Polymerase Chain Reaction (PCR)

                          ( sumber foto : https://i.ytimg.com/vi/iQsu3Kz9NYo/maxresdefault.jpg)   

• Apa itu PCR dan apa saja fungsinya ?

  Jawab : Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan suatu proses sintesis enzimatis untuk melipatgandakan suatu sekuens DNA tertentu secara in vitro. PCR memiliki fungsi yaitu untuk mendiagnosa infeksi, investigasi kriminal, riset genetik, dan biologi molekuler/ rekombinan DNA.

• Peralatan apa yang diperlukan untuk PCR dan bahan-bahan apa saja yang diperlukan serta fungsinya masing-masing?

Jawab : Peralatan yang digunakan ialah mesin PCR/ thermo cycler dan ultraviolet transilluminator. Bahan yang digunakan ialah :

1.      DNA template yang berfungsi sebagai cetakan untuk membentuk molekul DNA yang baru yang sama. DNA yang digunakan dapat berasal dari DNA plasmid, DNA kromosom, dan DNA lainnya tetapi DNA yang digunakan harus mengandung fragmen DNA target.

2.      Primer yang berfungsi sebagai prekursor awal atau untuk memulai proses replikasi DNA serta menyeleksi fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan menyediakan gugus hidroksi pada ujung 3’

3.      4 macam nukleotida dalam bentuk trifosfatnya yaitu deoxynucleotide triphospates (dNTPs) yang terdiri dari deoksiadenosin trifosfat (dATP), deoksintimidin trifosfat (dTTP), deoksisitidin trifosfat (dCTP), dan deoksiguanosin trifosfat (dGTP). dNTPs berfungsi sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA. dNTPs akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA templat.

4.      Larutan buffer yang berfungsi untuk mempertahankan pH medium

5.      Ion Mg²⁺ yang berasal dari MgCl₂ yang berfungsi sebagai kofaktor untuk menstimulasi aktivitas DNA polymerase, sehingga dengan adanya MgCl₂ akan meningkatkan interaksi primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP (senyawa antara).

6.      Enzim polimerase DNA yang berfungsi untuk mengkatalisis reaksi polimerisasi DNA

 

• Ada 3 tahapan proses PCR, apa saja dan apa fungsinya masing-masing ?
  

Jawab :

1.      Denaturasi DNA merupakan proses pembukaan DNA untai ganda menjadi DNA untai tunggal. Ini biasanya berlangsung sekitar 3 menit, untuk meyakinkan bahwa molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak lengkap mengakibatkan DNA mengalami renaturasi (membentuk DNA untai ganda lagi) secara cepat, dan ini mengakibatkan gagalnya proses PCR. Adapun waktu denaturasi yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase. Aktifitas enzim tersebut mempunyai waktu paruh lebih dari 2 jam, 40 menit, 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5^oC.

2.      Annealing merupakan proses penempelan sepasang primer DNA pada template yang sesuai pada ujung kedua template yang berlawanan dan terjadi pada suhu 60°C.

3.      Amplifikasi atau pemanjangan merupakan proses dimana enzim Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3’. Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 72^oC diperkirakan 35 – 100 nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target.

 

 

• Dengan cara bagaimana dapat diketahui bahwa proses PCR berhasil ?
  

Jawab :

Keberhasilam proses PCR dapat dilakukan dengan cara DNA hasil amplifikasi dipisahkan berdasarkan molekulnya melalui proses elektroforesis  kemudian dianalisis menggunakan UV Transluminator. Sampel produk PCR yang positif mengandung DNA dapat dilihat dengan adanya pita terang pada gel.